GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察

GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察

实验原理：
1.GFP报告基因
 全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。
3.表达载体：
植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥； 卡那霉素抗性培养基筛选，
卡那霉素:
抗生素
影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。

GFP转基因植株 野生型植株 GFP转基因植株 转基因植株
1/2MS培养基 1/2MS卡那抗性培养基

实验材料：
GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基 ；1/2MS卡那抗性培养基； 75％乙醇；10％NaClO；无菌水。

实验步骤：
1.种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）；
2.751min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
3.10％xiaodu10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）；
5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。

实验结果：
少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。

注意事项：
严格无菌操作.
xiaodu过程动作要快.
枪头不要重复使用，物品不要拿出超净台.
点种时每个位置尽量只点一颗子.
操作时尽量避免说话和人员走动.
注意小组内的配合和小组间的协调.

思考题：
1 .本实验用的了两种培养基，有何不同？主要作用是什么？
 实验中分别用到了1/2MS培养基和1/2MS卡那抗性培养基。MS培养基是一种常用的植物组织培养基；在1/2MS培养基中无机盐为MS培养基的一半。但在1/2MS卡那抗性培养基中添加了一种抗生素—卡那霉素。卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。
2.什么是GFP? 在生物学研究中有何用途？
GFP是绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，可以起到标记目的基因的作用。
3.GFP主要使用什么颜色的激发光？你观察到得荧光是什么颜色？
GFP在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光、

标注：

在植物分子生物学研究中，绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，被广泛应用于目的基因的亚细胞定位和转基因植株的阳性筛选。本文以拟南芥为模式植物，介绍从种子消毒、抗性筛选到活体荧光观察的完整实验流程。

1. 实验原理

GFP（Green Fluorescent Protein）源自维多利亚多管水母，是由238个氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下可发出绿色荧光。实验中，我们将微管结合蛋白基因 MAP65-1 构建至植物表达载体，通过农杆菌介导法转入拟南芥。利用 卡那霉素抗性基因 作为筛选标记，在含卡那霉素的培养基上，未转化的野生型植株因蛋白合成受阻而黄化死亡，转化植株则能正常生长，从而实现阳性苗的初步筛选。

2. 实验材料

GFP转基因拟南芥种子及野生型对照；1/2 MS培养基；1/2 MS卡那霉素抗性培养基；75%乙醇；10% NaClO；无菌水。

3. 实验步骤

1. 
   

   春化与消毒：将种子置于无菌水中，4℃冰箱春化过夜。取出后依次用75%乙醇处理1 min、10% NaClO处理10 min进行消毒，期间需不断混匀。

   
   

2. 
   

   清洗与播种：消毒结束后尽量吸净液体，用无菌水清洗3遍。用牙签将种子点播于培养基表面（每皿4-5粒，分布均匀），封膜并做好标记。

   
   

3. 
   

   培养：将培养皿置于培养架上进行垂直或水平培养，定期观察生长情况。

   
   

4. 荧光观察

培养一段时间后，野生型植株在卡那霉素培养基上会逐渐黄化枯萎，而转基因阳性植株长势良好。此时，可利用手持式荧光蛋白激发光源（如LUYOR-3415系列，选用450nm左右波段）对植株进行照射。配合专用滤光眼镜，可在非暗室条件下直接观察到转基因植株发出的明亮绿光，进一步确认 MAP65-1 基因在根、下胚轴及叶片表皮细胞中的表达情况。